本港台开奖现场j2

76633王中王论坛多发性骨髓瘤遗传学检测专家共识

ڣ2019-11-21

  【摘要】多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种高度异质性的血液系统肿瘤,患者生存时间存在较大差异。根据MM的预后因素进行危险度分层,进行个体化治疗,有助于提高疗效、减轻治疗相关毒性。遗传学异常是MM危险度分层的基础。近年来,虽然遗传学检测对于MM的重要意义在国内已经取得共识,但存在检测方法不规范、阳性阈值混乱、临床价值不明确等一系列问题,亟需规范。为此有必要制订MM的遗传学检测专家共识,以规范国内MM的遗传学检测。

  多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种高度异质性的血液系统肿瘤,患者生存时间存在较大差异。随着蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和新型单克隆抗体等新药的临床应用,MM患者的疗效得到了显著的提高。根据MM的预后因素进行危险度分层,进行个体化治疗,有助于提高疗效、减轻治疗相关毒性。遗传学异常是MM危险度分层的基础[1-2],遗传学异常的检测技术主要包括染色体核型分析、荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization,FISH)、基因表达谱、二代测序和微阵列比较基因组杂交等[3]。基因芯片检测技术复杂、成本高,尚不适合临床常规开展。美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)指南将染色体核型和FISH技术作为初诊MM的主要遗传学检测技术。FISH具有快速灵敏、特异性高、不需要中期分裂相的特点,弥补了常规染色体核型检测需要中期分裂相、分辨率低的不足,成为MM遗传学检测的主要方法。近年来,虽然遗传学检测对于MM的重要意义已经取得共识,但国内MM遗传学检测存在检测方法不规范、阳性阈值混乱、临床价值不明确等一系列问题,亟需进一步规范。为此我们制订了MM的遗传学检测专家共识,以规范国内MM的遗传学检测。

  MM肿瘤细胞为终末分化细胞,增殖率较低,传统的染色体制备很难获得足够的分裂相,加之送检标本中肿瘤细胞比例较低,导致核型异常检出率低。我国来自52家医院672例MM患者标本的多中心研究结果显示:常规染色体核型分析异常检出率为22.1%[4]。针对MM细胞增殖活性低的特点,染色体制备时可以采用细胞因子刺激MM细胞增殖,延长培养时间以期获得足够的中期分裂相。Lai等[5]采用细胞因子GM—CSF(30 ng/mL)联合IL-6(2000 U/mL)刺激6d培养法,对151例MM患者进行染色体核型分析,129例获得可分析的中期分裂相,其中66例(51%)发现克隆性染色体异常,提示加人细胞因子和延长培养时间可能能够克服部分MM常规染色体核型分析异常检出率低的问题。

  MM的核型改变多同时包含数量和结构改变的复杂核型异常。绝大多数为非整倍体核型,其中超二倍体(48~74条染色体)(30%~70%),常伴有3、5、7、9、11、15、17和19号染色体三体,非超二倍体(48或 74条染色体)常伴有13、14、16和22号染色体缺失以及14q32易位。在常规核型分析中超二倍体患者对化疗敏感,预后较好;低二倍体是传统化疗和大剂量化疗联合自体造血干细胞移植的预后不良因素。近来有研究者认为常规染色体分析发现del(13)而非FISH检测的del(13)是预后差的指标[6]。

  对于常规染色体核型分析,专家共识为:(1)MM常规染色体核型分析虽然有一定的局限性,但在MM预后判断中仍有一定价值,常规染色体核型分析仍是MM遗传学检测的方法之一;(2)建议采用GM-CSF联合IL-6刺激6d培养法制备染色体标本,以期获得更多可供分析的分裂相。

  MM的FISH检测有其特殊性。与其他恶性血液疾病不同,许多MM患者的肿瘤细胞在骨髓中比例较低且分布不均匀,加之骨髓抽吸过程中会发生外周血的稀释,浆细胞比例在遗传学检测样本中的比例一般仅占有核细胞的1%~20%。使骨髓涂片中浆细胞比例较高的患者,遗传学检测样本中浆细胞比例仍然可能非常低。因此,对于MM进行FISH检测时,如何准确的识别肿瘤细胞而不被正常细胞所干扰是首先需要解决的问题。应用FISH进行MM遗传学检测之前,需要进行浆细胞富集或者标记,而不能直接采用全骨髓标本进行FISH检测。如采用未经处理的骨髓标本进行FISH检测,检测结果易受实验条件、检测人员等干扰,并且容易出现接近阈值的结果,难以判读。中国医学科学院血液病医院发现对MM患者骨髓标本经过CD138磁珠分选后进行FISH检测,浆细胞分选可以显著提高遗传学异常检出率[7];近期研究还发现,具有某种遗传学异常浆细胞克隆的大小同样具有较高的临床价值[8]。使用未经处理的骨髓标本进行检测,由于受到骨髓中正常单个核细胞的影响,难以获取这部分信息。国外一般采取CD138免疫磁珠分选、胞浆轻链(cytoplasmic light chain,cIg)富集或者标记浆细胞。

  CD138免疫磁珠分选结合FISH检测是目前最常用的检测方法。一般20 mL骨髓可以满足检测需要,分选阳性率90%左右。CD138磁珠分选所需设备简单,富余的浆细胞可以用于建立MM标本库。缺点是手工操作较多,比较耗费时间,购买免疫磁珠增加检测成本。条件允许的单位,可以使用autoMACS®Pro进行磁珠分选,节省时间和人力成本。胞质轻链免疫荧光结合FISH(cIg-FISH)采用单个核细胞滴片后直接与探针杂交,洗片后再加入相应的抗轻链的抗体以标记浆细胞,计数细胞质着色的浆细胞的遗传学改变。clg-FISH操作前需要明确患者克隆性浆细胞轻链类型,以便选择正确的轻链抗体。值得注意的是,FISH检测时常需要对细胞膜进行一定程度的破坏,以利于探针与细胞核内DNA的结合。应用clg-FISH技术时,不建议使用低渗法处理骨髓单个核细胞,以免细胞膜破坏过度,难以对轻链进行标记。此外,如果患者浆细胞比例较低,进行cIg-FISH检测,可能会难以计数到100个浆细胞。

  对于FISH检测技术的选择,专家共识为:(1)不能直接采用全骨髓标本进行FISH检测,必须进行浆细胞的富集或者标记;(2)不能根据骨髓涂片中浆细胞的比例高低决定是否进行浆细胞的富集或者分选;(3)CD138分选纯化富集浆细胞结合FISH技术和cIg-FISH技术在结果的可靠性和特异性方面有较好的一致性[9],建议国内同行尽量根据条件选用这两种技术之一。应用cIg-FISH技术时,最好选取浆细胞比例较高的患者。

  欧洲骨髓瘤工作组曾在21个实验室发起MM的FISH检测质量控制,寄送10例纯化的浆细胞到21个实验室检测t(4;14)、t(11;14)、t(14;16)、del(13)(q14)和del(17)(p13)5种遗传学异常,发现约0.94%的假阳性和1.28%假阴性率,但各实验室阳性细胞率有明显差异,差异率有的高达60%[10],因此对MM的FISH检测应定期进行质量控制。

  为了提高FISH检测结果的可靠性,对标本的制备和FISH的检测过程应进行以下的规范:(1)骨髓标本应尽可能抽取第一管标本,最好进行多部位穿刺,建议采用EDTA抗凝剂抗凝;(2)标本应尽早送至实验室,以便能24h内及时处理;(3)制片最好采用甩片机使玻片上的细胞均匀分布;(4)在分选和制片过程中采用RPMl1640(含5%FBS)培养基进行稀释,以保持细胞形态无变形和破坏;(5)最重要的是,瘤细胞须经过纯化或用特殊标记定位,分选浆细胞纯度在90%以上,至少应在70%以上,具体方法由各实验室根据自身条件确定;(6)探针需确保质量,最好能选用性能稳定的已商业化的探针;(7)对于扩增和缺失的核型检测建议同时标记相应的着丝粒探针;(8)临床报告表述清楚,需明确检测方法、使用的探针、计数的细胞数目以及阳性细胞率等,1q21扩增需标明扩增拷贝数。

  在NCCN指南将FISH检测del(13q14)、del(17p13)、t(4;14)、t(11;14)、76633王中王论坛!t(14;16)以及lq21扩增作为初诊MM的检测指标。在美国梅奥医学中心骨髓瘤分层(Mayo Stratification of Myeloma and Risk—AdaptedTherapy,mSMART)共识和国际骨髓瘤工作组危险分层中,上述遗传学异常是主要的危险分层指标。伴有del(17p13)的MM患者预后极差,硼替佐米、来那度胺等新药以及大剂量化疗均不能克服其预后不良影响[11-13];1q21扩增也是接受蛋白酶体抑制剂治疗的MM患者的重要预后不良因素;而t(4;14)(p16.3;q32)、t(14;16)(q32;q23)和t(14;20)(q32;q11)提示预后差;随着蛋白酶体抑制剂硼替佐米的应用,t(4;14)(p16.3;q32)已由高风险因素转化成中风险因素[12];伴t(11;14)(q13;q32)曾经被认为是预后良好的标记,但Sasaki等[14]分析了993例自体造血干细胞移植的MM患者预后,结果显示正常核型、t(11;14)(q13;q32)和高危遗传学异常患者的3年无事件生存率分别为47%、27%和13%,3年总生存率分别为83%、63%和34%,说明t(11;14)(q13;q32)预后介于正常核型和高危遗传学异常之间。

  阳性阈值的判定,是应用FISH进行MM遗传学检测有争议的问题。血液系统疾病FISH阳性标准来源于对多份染色体核型正常供者骨髓的单个核细胞进行的相应探针检测,以阳性细胞数X±3s作为标准。使用这种方法建立阳性阈值存在两方面的问题:第一,浆细胞在正常骨髓中比例较低(0.25%左右),因此该标准是根据骨髓中其他单个核细胞建立的,而不是基于浆细胞获得的;第二,由于浆细胞胞质丰富,增加了探针与细胞核DNA结合的难度,MM的FISH检测往往信号强度不佳。因此,不能使用骨髓中其他单个核细胞获取的阈值,作为浆细胞FISH检测的阳性标准。如果采用上述方法建立的阈值,将导致大量假阳性的发生,尤其是拷贝数缺失的病例。

  MM的FISH阳性标准争议很大,各研究机构尚不统一。如欧洲骨髓瘤工作组建议采用20%作为数目异常的核型阳性标准界质,融合基因检测采用10%的阳性标准界值[10]。有的工作组根据生存曲线的差异设定阳性标准,如Avet-Loiseau等[15]在回顾性分析IFM的资料时根据生存曲线p)定为60%。中国医学科学院血液病医院通过研究发现,累及IGH的遗传学异常属于初始遗传异常,这些遗传学异常常累及绝大多数分选后的浆细胞,并且检出率不随疾病进程发展而发生变化。对于这部分遗传学异常来说,阳性阈值的设定对于结果影响较小[8]。del(17p)和amp(1q21)属于继发性遗传学异常,累及浆细胞比例不一,并且随病程进展检出率逐渐升高。阳性阈值的设定,对于这部分遗传学异常尤为重要[6]。

  在对实验方法进行标准化的基础上,应组织多中心临床研究,设定适合中国MM患者的阳性阈值。对于阳性阈值,专家共识为:(1)各实验室可分选多份染色体核型正常供者骨髓的浆细胞进行的相应探针检测,以阳性细胞数X±3s作为标准,避免使用正常骨髓单个核细胞建立的阳性阈值;(2)如实验室无法根据正常浆细胞得出阳性阈值,暂时参考欧洲骨髓瘤工作组的阳性阈值:基因拷贝数数目异常20%,融合基因为10%;(3)一般需计数200个细胞,对于高度纯化的标本或cIg-FISH最少可计数50个细胞数;(4)除了报告阳性/阴性结果外,还应该报告阳性细胞率;(5)有临床意义的阳性阈值标准应该根据我国大规模前瞻性研究结果确定。

  目前国际上比较公认的MM危险分层体系为2015年新修订的国际预后分期(R-ISS分期),R-ISS分期是在ISS分期基础上结合LDH和高危核型[(t(4;14)、t(14;16)和17p13缺失任何一个]进行分期,该分期能更好地诠释MM患者的预后(表1)。因此,专家共识建议采用R-ISS分期系统进行MM预后分层。

  [7] 安刚,李承文,李倩,等.免疫磁珠分选对荧光原位杂交检测多 发性骨髓瘤细胞遗传学异常的影响[J].中国实验血液学杂志, 2011,19(1):54-58.


友情链接:
神算高手中特网,308119.com,本港台开奖,本港台开奖现场,本港台开奖现场j2,香港本港台开奖现场直播,4682本港台开奖记录,23144本港台开奖结果。